技術原理
CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic
Repeats）是最(zui)新出(chu)現的一種(zhong)由(you)sgRNA指(zhi)導(dao)Cas核(he)酸酶對(dui)靶向基因(yin)進(jin)行特(te)定(ding)DNA修(xiu)飾(shi)的技術(shu)。在這一系(xi)統(tong)(tong)中，sgRNA引導(dao)序列(lie)靶定(ding)位點剪切雙鏈DNA達到對(dui)基因(yin)組DNA 進(jin)行修(xiu)飾(shi)的目(mu)(mu)的。CRISPR/Cas9系(xi)統(tong)(tong)能(neng)夠對(dui)小鼠(shu)基因(yin)組特(te)定(ding)基因(yin)位點進(jin)行精確編輯，目(mu)(mu)前(qian)瑞思元已經成(cheng)功將此技術(shu)應用于小鼠(shu)基因(yin)敲(qiao)除/敲(qiao)入模型制備，以及條件性敲(qiao)除（Loxp系(xi)統(tong)(tong)）模型制備。
目前瑞思元采取優(you)化(hua)過的(de)(de)野生(sheng)型Cas9和雙(shuang)(shuang)切口Cas9n（Optimized Cas9 System,OCAS and OCASn）。采用優(you)化(hua)過的(de)(de)雙(shuang)(shuang)切口Cas9n(OCASn)可以將脫(tuo)靶效應(ying)降到最低(di)。
常規基因敲入
利用CRISPR/Cas9基因(yin)(yin)敲入技術，針對靶基因(yin)(yin)設計、構建相應的gRNA質粒和donor質粒，通(tong)過Cas9核酸酶的切割作用和同源臂(bei)的同源重組(zu)，引入特定的突變、報告基因(yin)(yin)（如EGFP、mCherry、RFP、LacZ等）或需要表達的(de)功能(neng)性cDNA（如cre、Dre等(deng)）到目的基因(yin)的特定位(wei)點。
條件性基因敲(qiao)入
利用(yong)CRISPR/Cas9基(ji)因敲入技術，針對靶(ba)基(ji)因設計、構建相應的gRNA質粒和donor質粒，將外源基因或(huo)特定突變敲入引入到基因(yin)組目的(de)基因(yin)的(de)特(te)定位點。
Rosa26位點定點敲入
; 根據(ju)Rosa26基因(yin)序(xu)列(lie)(lie)設計合成sgRNA，將構建(jian)包含(han)(han)同(tong)源(yuan)序(xu)列(lie)(lie)和目的序(xu)列(lie)(lie)的片(pian)段與Cas9、sgRNA共(gong)同(tong)顯微注射入受精(jing)卵(luan)中(zhong)，Cas9/sgRNA復合體與基因(yin)組(zu)靶序(xu)列(lie)(lie)結合并切割雙鏈DNA，以(yi)含(han)(han)目的片(pian)段的同(tong)源(yuan)序(xu)列(lie)(lie)為模版修(xiu)復基因(yin)組(zu)DNA，最終(zhong)獲得在Rosa26基因(yin)intron中(zhong)定點插入片(pian)段的大小鼠(shu)。
制備流(liu)程
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